熒光是一種光致冷發光現象。當某種常溫物質經某種波長的入射光(通常是紫外線或X射線)照射,吸收光能后進入激發態,并且立即退激發并發出出射光(通常波長比入射光的的波長長,在可見光波段);而且一旦停止入射光,發光現象也隨之立即消失。具有這種性質的出射光就被稱之為熒光。一般以持續發光時間來分辨熒光或磷光,持續發光時間短于10-8秒的稱為熒光,持續發光時間長于10-8秒的稱為磷光。在日常生活中,人們通常廣義地把各種微弱的光亮都稱為熒光。
生化和醫藥中熒光的應用
熒光在生命科學領域領域有著廣泛的應用。人們可以通過化學反應把具有熒光性的化學基團粘到生物大分子上,然后通過觀察示蹤基團發出的熒光來靈敏地探測這些生物大分子。
舉例:
采用熒光標記的鏈終止劑所得到的DNA測序圖
用于對DNA進行自動測序的鏈末端終止法:
在原初的方法中,需要對DNA的引物端進行熒光標記,以便在測序凝膠板上確定DNA色帶的位置。在改進的方法中,對作為鏈終止劑的4種雙脫氧核苷酸(ddTBP)分別進行熒光標記,電泳結束后不同長度的DNA分子彼此分開,經紫外線照射,4種被標記的雙脫氧核苷酸發出不同波長的熒光。通過熒光濾光片分析熒光的光譜便可以分辨出DNA的序列。
DNA探測:溴化乙啶(EtBr)是一種熒光染料,當它在溶液中自由改變構型時,只能發出很弱的熒光;當它嵌入核酸雙鏈的堿基對之間與DNA分子結合后,便可以發出很強的熒光。因此在凝膠電泳中,一般加入溴化乙啶對DNA染色。
DNA微陣列(生物芯片):需要對基因組探針進行熒光標記,最后通過熒光濾光片分析熒光信號確定靶標序列。
免疫學中的免疫熒光檢查法:對抗體進行熒光標記,從而可以根據熒光的分布和形態確定抗原的部位和性質。
流式細胞儀(又稱熒光激活細胞分選器,FACS) :對樣本細胞進行熒光標記,再用激光束激發使之產生特定的熒光,然后用光學系統檢測并將信號傳輸到計算機進行分析,從而得到細胞相應的各種特性。
熒光技術還被應用于探測和分析DNA及蛋白質的分子結構,尤其是比較復雜的生物大分子。
水母發光蛋白(英語:Aequorin)最早是從海洋生物維多利亞多管發光水母中分離出來的。當它與Ca2+離子共存時,可以發出綠色的熒光。這一性質已經被應用于實時觀察細胞內Ca2+離子的流動。水母發光蛋白的發現推動了人們進一步研究海洋水母并發現了綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)。綠色熒光蛋白的多肽鏈中含有特殊的生色團結構,無需外加輔助因子或進行任何特殊處理,便可以在紫外線的照射下發出穩定的綠色熒光經過高截止的熒光濾光片過濾雜光之后可以看到清晰的信號,作為生物分子或基因探針具有很大的優越性,所以綠色熒光蛋白及相關蛋白已經成為生物化學和細胞生物學研究的重要工具。
螢光顯微成像技術:全內反射熒光顯微鏡
很多生物分子具有內稟的熒光性,不需要外加其他化學基團就可以發出熒光。有時候這種內稟的熒光性會隨著環境的改變而改變,從而可以利用這種對環境變化敏感的熒光性來探測分子的分布和性質。例如膽紅素與血清白蛋白的一個特殊位點結合時,可以發出很強的熒光。又如當血紅細胞中缺少鐵或者含有鉛時,會產生出鋅原卟啉而不是正常的血紅素(血紅蛋白);鋅原卟啉具有很強的熒光性,可以用來幫助檢測病因。